50%缩足测量实验方法

啮齿动物的临床前模型对于探索病理生理机制以及寻找新型镇痛药物而言，具有不可估量的价值。然而啮齿动物的疼痛评估往往充满挑战，它们对机械或热刺激的反应变化，被用作衡量疼痛敏感性的行为指标。由于动物无法用语言表达自己是否感到疼痛，所以可以用缩足反应来代替对感觉的语言报告，当实验动物感受到疼痛时，爪子会立即收缩。

历史背景

十九世纪九十年代，生理学家Maximilian von Frey提出疼痛是一种独立的触觉特性，与触摸、热和冷并列，且与高阈值自由神经末梢的刺激有关，来测量机械性疼痛（针刺痛觉），是目前评估实验鼠机械性疼痛的常用方法。

1983年Dixon使用Von Frey纤维丝提出了up–down method，1994年Chaplan SR等为了检测啮齿动物50%缩足阈值将此方法做了进一步的修改，Up–Down Method是在目标力水平的5%标准差范围内单独校准，非常准确。目前引用up–down method文献已达上万篇，是机械痛阈测量的金标准。且在测量缩足阈值的出版文献中，大约60%使用了up–down method或其修正版本。

实验前准备

适应环境

将啮齿类动物放置于底部为网格的特制有机玻璃隔箱内适应20min左右，使动物较好的适应当前环境，四肢活动不频繁为止；

预实验

在实验开始之前可以先用Von Frey纤维丝对实验动物进行预实验，测量实验动物缩足阈值的大致范围，以完成实验动物和纤维丝的筛选。尽可能选择缩足阈值相近的实验动物和连续编号的纤维丝以保证实验数据的精确性。 

开始操作

01. 操作步骤

1. 取一系列North Coast Von Frey纤维丝（如 0.4、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0g，共9根），我们取中位数 4.0g 开始对动物脚掌中部皮肤进行刺激，纤维丝弯曲至“C”或“S”型并维持6-8s，观察动物是否缩足并记录；每根纤维丝测试5次，每次间隔15s，五次有三次缩足即可认为有反应 。注意区别由于身体活动引起的缩足反应；

2. 动物无反应记为“O”，有反应（缩足或舔足）记为“X”。无反应时，给予大一级力度的纤维丝刺激（即4.0g的纤维丝刺激动物脚底没有反应时，下一步选择6.0g的纤维丝继续刺激），有反应时则改用小一级的纤维丝刺激（即4.0g的纤维丝刺激动物脚底动物出现缩足反应，下一步选择2.0g的纤维丝继续刺激），反复类推；

3. 当动物出现“OX”（第一次没缩足反应，第二次有缩足反应）或“XO”（第一次有缩足反应，第二次没有缩足反应） 的骑跨时，重复之前的操作步骤，再连续往后测量四次，得到一串以“O”或“X”组合的序列^①，将该序列与最后一根测试丝的编号输入动物50%缩足阈值公式，计算出动物的50%缩足阈值；

4. 动物50%缩足阈值（g）=（10^[Xf+kδ]）/10000，其中 Xf ^②为最后一根测试丝编号，如下图所示8.0g的north coast纤维丝编号为4.93。δ为所取各根纤维丝克数取对数后的均差，这个数值和north coast纤维丝编号很相近，为了方便计算，因此δ可以近似认为是所选纤维丝编号的均差即δ＝（最大纤维丝编号-最小纤维丝编号）/（n-1），n为所选纤维丝的数量。k为根据测量获得的“X”、“O”序列查表后获得的系数值；

02. 注意事项

• 这里所说的“O”或“X”组合的序列是指从最开始测试进行记录，出现骑跨值往后再记录四次，即最少六位，最高九位的一个序列，低于六位的序列不予考虑。如动物在最开始就在 4.0 和 6.0 之间出现骑跨，而后几次测试依旧反复，则其序列 为“OXOXOX”；若动物开始没出现骑跨，而后在 8.0 和 10.0 之间出现骑跨并反复，则其序列为“OOOXOXOX”；

• Xf 在这里直接使用测试丝编号，但亦有文献使用最后一根丝目标力度值（以 mg 为单位）10 倍的对数值作为 Xf 代入公式 计算，即 Xf=lg（10000f），其中 f 为纤维丝目标力度（g）。我们以此法换算出的 Xf 值与纤维丝本身编号数值很相近，因此可直接使用纤维丝编号作为 Xf 代入计算。

03. 计算示例

在0.4、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0g，共9根纤维丝，我们选择中间的 4.0g 力度开始测试

第一轮：选择4.0g纤维丝刺激五次，每次间隔15s，五次中未发生3次及以上的缩足反应(O)

选择6.0g纤维丝刺激五次，每次间隔15s，五次中未发生3次及以上的缩足反应(O)

选择8.0g纤维丝刺激五次，每次间隔15s，五次中发生3次及以上的缩足反应(X)

此时发生了第一次骑跨，重复之前的测试继续往后测四轮

第二轮：选择6.0g纤维丝刺激五次，每次间隔15s，五次中未发生3次及以上的缩足反应(O)

第三轮：选择8.0g纤维丝刺激五次，每次间隔15s，五次中发生3次及以上的缩足反应(X)

第四轮：选择6.0g纤维丝刺激五次，每次间隔15s，五次中未发生3次及以上的缩足反应(O)第五轮：选择8.0g纤维丝刺激五次，每次间隔15s，五次中未发生3次及以上的缩足反应(O)

第一步 根据序列确定k值：此序列为OOXOXOO 根据k值表可知k＝0.039

第二步 根据编号算均差：将这9根纤维丝对应的编号（3.61、4.08、4.17、4.31、4.56、4.74、4.93、5.07、5.18）取均差δ＝（5.18-3.61）/（9-1）＝0.19625，

第三步 确定Xf：最后一根纤维丝为8.0g，可在north coast纤维丝上查看到对应的编号为4.93，

第四步 代入公式计算：代入公式计算可以得出g＝10^{[4.93+0.039*0.19625]}/10000＝10 ^0.93765 ，根据科学计算器可以得出动物50%缩足阈值（g）＝8.66g，即为动物50%缩足阈值。

04. 实验注意事项

1. 若从4.0g开始，动物连续四次出现反应（即到0.4g动物仍出现缩足或舔足反应）或连续四次未出现反应（即到 15.0g 动物仍不出现缩足或舔足反应），即可直接使用 0.4g或15.0g作为动物50%缩足反应阈值。

2. 若一开始已出现骑跨反应，但测试到最小或最大纤维丝时不足 4 次（如 XXXOXX），则继续使用最小或最大纤维丝按照Up–Down method测量记录，以排除假阳性或假阴性可能。

North Coast纤维丝套件

01. 产品简介

North Coast Von Frey纤维丝痛阈测试包，是用于评估皮肤触觉灵敏度的经典工具。由20根不同规格的Von Frey纤维丝组成，单只可分为纤维丝头、保护套和手柄三部分。测量丝的力度为0.008克-300克。Von Frey纤维丝触觉测试不仅可应用于大、小鼠的足底，在临床上也广泛使用，可用于触觉测试及高知觉和低知觉诊断。

02. 应用领域

基础研究应用

1. 研究机械感受受体编码机制: 通过测定不同纤维直径对应的感受阈值,可推断不同种类感受受体的特性

2. 评估神经损伤后重建: 观察纤维丝刺激感受阈值的恢复,可监测神经再生和功能修复过程

3. 研究疼痛调控机制: 使用动物模型,研究药物或干预措施对机械性疼痛阈值的影响,有助于认识疼痛调控通路

临床诊断应用

1. 评估周围神经损伤程度: 通过测定患者对纤维丝刺激的感知阈值,可判断感觉神经功能的损害程度。这有助于诊断和监测周围神经病变

2. 诊断糖尿病神经病变: 糖尿病患者常出现机械性感觉异常,使用纤维丝可客观评估感觉神经功能,有助于诊断糖尿病周围神经病变

3. 评估中枢性疼痛: 中枢性疼痛如脊髓损伤后疼痛,可使用纤维丝评估机械性感觉阈值的变化, 帮助诊断